Jurnal 9

Effects of Iron and Phytic Acid
on Production of Extracellular Radicals

by Enterococcus faecalis

DANNY R. MOORE,* YASHIGE KOTAKE, AND MARK M. HUYCKE*,1
*The Muchmore Laboratories for Infectious Diseases Research, Research Service,
Department of Veterans Affairs Medical Center, and Department of Medicine,
University of Oklahoma Health Sciences Center, Oklahoma City, Oklahoma 73104;
Free Radical Biology and Aging Research Program, Oklahoma Medical Research Foundation,
Oklahoma City, Oklahoma 73104

Pengaruh Asam Besi dan fitat pada Produksi Radikal Ekstraseluler
oleh Enterococcus faecalis

 Enterococcus faecalis adalah komensal usus manusia yangmenghasilkan superoksida ekstraselular, hidrogen peroksida, danradikal hidroksil sementara menjajah saluran usus. Untukmenentukan apakah faktor makanan terlibat dalam kolorektalkanker mempengaruhi produksi oksidan oleh E. faecalis, radikal yangdiukur pada tikus dijajah dengan mikroorganisme ini sementaradiet dilengkapi dengan besi atau asam fitat. Radikal hidroksilKegiatan diukur dengan pengujian untuk hidroksilasi aromatikproduk D-fenilalanin menggunakan fase-balik kinerja tinggikromatografi cair dan deteksi elektrokimia. Divitro, seperti yang diharapkan, besi ditingkatkan, dan asam fitat menurun,pembentukan radikal hidroksil oleh E. faecalis. Untuk tikus dijajah denganE. faecalis diberikan zat besi tambahan (740 mg elementalbesi sebagai fosfat besi per kg diet) atau asam fitat (1,2% b / b),ada perbedaan yang ditemukan dalam konsentrasi urin orto-ataumeta-isomer D-fenilalanin dibandingkan dengan tikus pada basaldiet. Radikal berair isi kolon yang lebihdinilai ex vivo dengan resonansi spin elektron menggunakan 5,5 -dimetil-1-pyrroline-N-oksida sebagai perangkap spin. Campuran thiyl(Sulfur-centered) dan oksigen berpusat radikal terdeteksidi semua diet. In vitro, spektrum yang sama diamati ketika E.faecalis diinkubasi dengan hidrogen sulfida, ber-teroksidasisistein, atau alkylsulfide, sebagai khas senyawa yang mengandung sulfuryang mungkin terjadi di isi kolon. Sebagai kesimpulan,kolonisasi usus dengan E. faecalis dalam model tikus menghasilkanradikal baik thiyl dan oksigen yang berpusat di isi kolon.Pembentukan radikal, bagaimanapun, tidak signifikan diubah olehsuplemen makanan jangka pendek dengan besi atau asam fitat. ExpBiol Med 229:1186-1195 2004Kata kunci: Enterococcus faecalis, radikal bebas, zat besi, dietasam fitat, hidroksilasi aromatik, resonansi spin elektronspektroskopiSetiap tahun pada basis global hampir satu juta orangdidiagnosis dengan kanker kolorektal (CRC), danini lebih dari setengah mati akibat komplikasi (1). ItuPeran flora komensal usus dalam etiologi CRCtelah memperoleh perhatian meningkat dalam beberapa tahun terakhir (2). Satubakteri pada khususnya, Enterococcus faecalis, telahdisarankan sebagai penyebab potensial CRC melaluiproduksi superoksida ekstraseluler (2, 3). Anionik inilead radikal oksidan kuat lainnya seperti hidrogenperoksida dan radikal hidroksil. Ini oksigen reaktifspesies telah terdeteksi dalam isi usus darihewan dijajah oleh E. faecalis (4, 5) dan dapat meningkatkantransformasi sel epitel melalui kerusakan oksidatifDNA (3). Namun, masih harus ditentukan apakahbacterially dimediasi stres oksidatif pada ususepitel berperan dalam karsinogenesis kolorektal.Ini fenotipe bakteri yang unik, yaitu, produksiradikal ekstraseluler, dinyatakan oleh mayoritas E.faecalis isolat dari feses normal, tetapi beberapa lainnya ususcommensals (6). Enterococcus faecalis strain yang menghasilkansuperoksida ekstraseluler umumnya menjajah manusiasaluran usus (6), meskipun, secara keseluruhan, terdiri enterococci, 1% dari total flora yang fecal (7-9) dan tidak biasanyagenus dominan. In vitro dan in vivo dari pembentukanekstraseluler superoksida oleh E. faecalis telah terbuktikerusakan DNA sel epitel kolon, mungkin melaluihidrogen peroksida derivatif yang berdifusi ke dalam sel (10).DNA bisa dioksidasi oleh hidrogen peroksida melaluigenerasi radikal hidroksil pada situs di mana DNAterkait dengan besi (11):Fe2þ þ þ hth H2O2! Fe3þ þ? OH þ H2O Lain peristiwa biologis merusak, di sampingReaksi Fenton ditampilkan di sini, dapat diprakarsai oleh superoksida.Misalnya, superoksida diketahui menyebabkan peroksidasipolyunsaturated asam lemak dalam membran sel epitel.Hal ini, pada gilirannya, dapat menyebabkan pembentukan kerusakanproduk seperti 4-hidroksinonerial dan malondialdehid yangsecara bebas diffusible dan sangat mutagenik (12).Besi merupakan katalis penting dalam reaksi redoks danOleh karena itu faktor risiko potensial untuk CRC melalui pro-oksidanmekanisme (13-16). Zat besi atau besi diambil terapisebagian besar diserap oleh usus. Sebagian masuk ke dalamusus besar, di mana, dalam teori, bisa menghasilkan hidroksilradikal di hadapan superoksida atau hidrogen peroksida.Dalam model di mana hewan secara kronis terpaparsuplemen zat besi, yang peroksidasi dari epitel ususpeningkatan lipid sel, dan sel crypt menunjukkan hiperproliferatifperubahan (17, 18). Akhirnya, studi epidemiologi menunjukkan,meskipun tidak konsisten, risiko lebih besar untuk CRC denganmeningkatkan zat besi atau besi total tubuh (15). Berbeda denganbesi sebagai faktor risiko potensial untuk CRC, asam fitat atau myoinositolhexakisphosphate adalah agen antikanker yang potensial(19, 20). Meskipun efek dari asam fitat yang pleiotrophic,salah satu fitur yang menonjol adalah kemampuannya untuk chelate besidan menghambat reaksi Fenton (21). Asam fitat tertelanmungkin membatasi kerusakan oksidan pada epitel usus dengan inimekanisme.Dalam studi ini, kami menilai efek dari besi dan fitatasam terhadap produksi radikal oleh E. faecalis in vitro dan sebagaisuplemen makanan dalam terjajah tikus. Radikal Ususterdeteksi oleh hidroksilasi aromatik D-fenilalanindan melalui berputar resonansi (ESR) spin elektronmenjebak. Hasil kami menunjukkan bahwa besi dan asam fitat,walaupun memiliki signifikan efek in vitro pada radikalformasi, menunjukkan efek minimal dalam terjajah tikus.Anehnya, thiyl (atau belerang berpusat) radikal, bersama denganoksigen berpusat spesies, umumnya diamati padaisi kolon, menunjukkan bahwa campuran radikaldibentuk oleh E. faecalis dalam usus.Bahan dan MetodeKimia, Bakteri, Media, dan ProduksiSuperoxide ekstraseluler. Metanol, asetonitril, dantetrahidrofuran dibeli dari Fisher Scientific(Pittsburgh, PA). Semua bahan kimia lainnya yang analitisreagen grade dari Sigma (St Louis, MO). Enterococcusfaecalis regangan OG1RFSS merupakan turunan dari mulut manusiamengisolasi (22) dengan resistensi spontan terhadap rifampisin, fusidicasam, streptomisin, dan spektinomisin (4, 23) dan sebaliknyamirip dengan anggota spesies ini mampu menghasilkansuperoksida ekstraseluler (6). Enterococci dari ususisinya dicacah dengan empedu-esculin-azida agarpiring (Difco) seperti yang dijelaskan sebelumnya (24). Dalam tingkat in vitroproduksi superoksida ekstraseluler oleh E. faecalis adalahditentukan dengan menggunakan c uji ferricytochrome seperti sebelumnyadijelaskan (4).Usus Kolonisasi Model. Laki-laki muda Wistartikus di kelompok 13-15 hewan diberi makan ad libitum baikbasal (AIN-93M dalam bentuk pelet dengan 34 mg zat besi per kg diet,ICN, Los Angeles, CA), besi ditambah (740 mgbesi elemental [sebagai besi fosfat] per kg diet), atau fitatasam ditambah (1,2% b / b) diet. Streptomisin danspektinomisin ditambahkan ke air minum (500 mg / L)setelah 11 hari pada diet basal atau tambahan. Tigahari kemudian, pada Hari 14, saluran usus terkolonisasi denganOG1RFSS melalui intubasi lambung seperti yang dijelaskan sebelumnya (3).Lima hari setelah kolonisasi, tikus diberikan Dphenylalanine(150 mg / kg) secara injeksi intraperitoneal.Enam puluh menit kemudian, sampel urin dikumpulkan, pellet untukmenghilangkan sedimen, dan disuntikkan ke dalam kolom untuk highperformancekromatografi (HPLC) analisis cair (lihatpembahasan berikut). Pada hari berikutnya, tikusdibius menggunakan dihirup isoflurane dan titik dua dipotong.Sampel isi kolon yang diuji oleh ESR berputarperangkap, berbudaya untuk menentukan konsentrasi enterococcal,dan diuji untuk besi dan peroksida.Besi dan Tes Peroksida. Plasma besi dan besi dalamisi kolon diuji menggunakan modifikasi kecilmetode Kok dan Liar (25). Sampel yang awalnyadiasamkan dengan asam Thioglycolic terkonsentrasi dan kemudian 2 MHCl dan diencerkan 1:02 (v / v) jenuh natrium asetat.Supernatan diencerkan dalam air suling 1:3.5 (v / v) danbathophenanthroline disulfonic asam ditambahkan ke 3 mM.Absorbansi diukur pada 536 nm setelah 30 detik.Hidrogen peroksida dan hidroperoksida dalam isi kolonditentukan oleh assay glutation peroksidase sebagaidijelaskan sebelumnya (3). Dalam pengujian ini glutation peroksidasemengkatalisis reduksi peroksida menggunakan glutathionesebagai reduktor (26). Alat tes pasangan daur ulangglutathione oleh glutation reduktase dengan oksidasiNADPH. Penurunan NADPH diikuti spektrofotometripada 340 nm menggunakan koefisien kepunahan molar6,23103 L / mol / cm. Azida ditambahkan ke campuran untuk menghambatkatalase yang dapat mencemari persiapan komersialglutation peroksidase. Konsentrasi Besi dan peroksida untukisi kolon dinormalkan dengan berat basah gramtinja.Hidroksilasi aromatik D-Fenilalanin.Serangan radikal hidroksil pada D-fenilalanin dapat menghasilkansalah satu dari tiga isomer tirosin (orto-, meta-, atau para-).Produk ini berupa dalam kondisi aerobik bilaabstrak radikal hidroksil hidrogen dari aromatikcincin (27). Identifikasi isomer ini dapat digunakan sebagaipenanda pengganti untuk produksi radikal hidroksil dalam sel,jaringan, dan hewan (28). Karena D-fenilalanin bukanlahsubstrat untuk hidroksilase fenilalanin, yang biasanyaditemukan dalam jaringan, itu dianggap sebagai target yang lebih spesifik daripadaL-fenilalanin. Uji, bagaimanapun, masih bisadikacaukan oleh racemases yang mengkonversi fenilalanin kiraldari D ke L-enansiomer, dengan hidroksilase fenilalaninkemudian menghasilkan para-tirosin. Para-isomer adalah,Oleh karena itu, nilai terbatas dalam pengujian ini.HasilEnterococcus faecalis regangan OG1RFSS menghasilkansuperoksida ekstraseluler berlebihan, hidrogen peroksida, danradikal hidroksil (3, 5). Tingkat produksi superoksida,yang diukur dengan c uji ferricytochrome menggunakan glukosa sebagaigula difermentasi, adalah 31 6 1.3 lmol/min/109 cfu. Pada 15dan 30 menit, tingkat menurun menjadi 20 6 0,1 dan 13 6 1.4lmol/min/109 cfu, masing-masing. Pada 60 menit, meski memiliki banyakglukosa masih tersisa di dalam buffer, superoksida adalagi terdeteksi. Demikian pula, perangkap berputar ESR terdeteksiDMPO aduk konsisten dengan superoksida dan hidroksilradikal. Seperti dengan ferricytochrome c uji, sinyal ESRditemukan bakteri diinkubasi dengan glukosa hingga 1 jamtapi tidak di luar itu titik waktu (Gambar 1). Manggansuperoxide dismutase dieliminasi sinyal aduk, mengkonfirmasikanasal mereka dari superoksida.Ketika asam fitat besi atau ditambahkan ke E. faecalis, tidak adaPerubahan signifikan yang diamati pada DMPO adduct atauKekuatan sinyal ESR (Gambar 1). Meskipun perangkap berputar ESRlebih sensitif untuk mendeteksi superoksida daripada ferricytochromec assay (29), kami tidak dapat mengukur kinetika olehberputar perangkap karena meningkatnya intensitas sinyal, yangakan menunjukkan produksi superoksida yang sedang berlangsung, adalahtidak terlihat. Radikal yang mudah dideteksi segera setelahSelain dari perangkap berputar, tetapi meningkatkan kekuatan sinyaltidak diamati meskipun bukti untuk melanjutkan superoksidaproduksi oleh c uji ferricytochrome. Penghambatanperangkap spin bukan karena larut oleh-produk sejakpenambahan supernatan dari bakteri diinkubasi denganglukosa tidak mempengaruhi spektrum untuk bakteri baru dicuci.Demikian pula, bakteri tampaknya tidak menurunkan DMPO sejakperangkap putar diinkubasi dengan bakteri masih diproduksi spektrum saatditambahkan ke bakteri baru dicuci. Selanjutnya, oksigenKeterbatasan tidak menjelaskan pengamatan ini sejak berputarmenjebak dalam sel datar terbuka, dengan oksigen tambahan,gagal untuk mengubah sinyal aduk dibandingkan dengan spektrum dariditutup sel datar. Aduk superoksida dan hidroksilDMPO, bagaimanapun, adalah rentan terhadap pembusukan yang difasilitasioleh anion superoksida (30). Interaksi ini dapat menjelaskan,bagian, temuan ini karena di bawah ini dalam kondisi in vitroakan ada produksi terus superoksida oleh E.faecalis untuk jangka waktu lebih lama daripada durasipercobaan spin-perangkap.Karena kesulitan ini, kami memutuskan untuk memeriksaefek besi dan fitat pada produksi radikal olehmengukur hidroksilasi D-fenilalanin (5).Awalnya, setiap potensi toksisitas asam fitat pada besi atau E.faecalis regangan OG1RFSS dinilai selama semalampertumbuhan BHI dengan 2.000 lm besi atau 1000 lm asam fitat.Penghambatan pertumbuhan tidak diamati, juga superoksidaproduksi diubah yang diukur dengan ferricytochrome cuji (data tidak ditampilkan). Bakteri tumbuh di BHI sendirian dankemudian dicuci diinkubasi dalam mengandung glukosabuffer dengan 0, 10, 50, atau 200 Lm sulfat besi dan 5 Dphenylalanine mM.Setelah 60 menit, peningkatan linier yang signifikan dalamtyrosines isomer diamati (7 - sampai 23 kali lipat) dibandingkandengan kontrol tanpa tambahan zat besi (Tabel 1). Hasil inimenyarankan bahwa suplemen besi ditingkatkan produksiradikal hidroksil oleh E. faecalis, mungkin melalui Fentonreaksi. Sebaliknya, 50, 200, dan 1000 Lm asam fitatkonsentrasi menurun secara signifikan dari tyrosines isomerpada 60 menit (oleh sekitar 2 - 4 kali lipat), mungkin denganpengkhelat jejak logam dalam buffer dan menghambat Fentonreaksi (21). Kecenderungan untuk penurunan tyrosines isomer,Namun, yang sangat tidak linier seperti peningkatan iniproduk untuk besi sulfat.Selanjutnya, dampak suplemen makanan jangka pendekdengan besi atau asam fitat pada produksi radikal bebas oleh E.faecalis diperiksa menggunakan model penjajahan tikus.Baik besi atau fitat diet asam ditambah punyaefeknya pada kepadatan enterococcal kolonisasiatau konsentrasi peroksida dalam isi kolon (Tabel 2).Seperti yang diharapkan, diet besi-ditambah meningkatkankonsentrasi besi dalam isi kolon dibandingkan dengan tikusmakan baik basal atau diet asam fitat-ditambah(Tabel 2). Tidak ada perbedaan signifikan secara statistikdicatat dalam kadar besi kolon rata-rata untuk asam fitat-dilengkapi dibandingkan dengan diet basal. Untuk menentukanapakah estimasi besi mungkin telah tertutup, sebagian,oleh ketidakmampuan Kok dan liar assay untuk mendeteksi besiterikat dengan asam fitat, asam fitat (50, 100, 200, atau 1000lm) ditambahkan ke dalam larutan 80 lm sulfat besi danbesi diuji. Besi terdeteksi ditemukan menurun14%, 25%, 29%, dan 36%, masing-masing, untuk inikonsentrasi asam fitat, yang menunjukkan hanya terbataspotensi gangguan. Konsentrasi rata-ratabesi plasma untuk tikus pada diet besi-ditambah adalahditinggikan (11.7 6 2.8 LM), seperti yang diharapkan, dibandingkan dengan tikuspada basal atau fitat diet asam ditambah (8.4 6 1.3dan 9,2 6 2,8 lm, masing-masing; P = 0,02 dengan analisisvarians).Ex vivo analisis ESR produksi radikal bebas dalamisi kolon dilakukan dengan menggunakan DMPO sebagai berairberputar perangkap. Meskipun beberapa derajat variabilitas diamatidi aduk DMPO seluruh diet (Gambar 2), simulasi komputer menunjukkan hampir semua spesimen mengandung campuran hidroksil(AN = 14,9 Gauss dan aH = 14,9 Gauss) dan thiyl (atau sulfurcentered)radikal (aN = 15,0-16,3 Gauss dan aH = 15,9-20,2Gauss), dengan radikal thiyl muncul sebagai dominanspesies. Spektrum pusat aduk thiyl terletak dikekuatan medan sedikit lebih rendah dari karbon-berpusat radikaladuk, menunjukkan bahwa spesies ini memiliki nilai g yang lebih besar.Karena belerang berpusat radikal biasanya memiliki nilai yang lebih besar gdari karbon-berpusat aduk, temuan ini adalah tambahanbukti positif untuk tugas yang benar adduct ini.Karena radikal thiyl tidak diamati in vitro ketikaE. faecalis adalah berputar terjebak dalam mengandung glukosa penyangga,kami memutuskan untuk menyelidiki apakah OG1RFSS bisa menghasilkanradikal thiyl saat terkena senyawa yang mengandung sulfur,yang mungkin ditemukan dalam usus besar. Bakteri yang berputarterjebak dalam glukosa yang mengandung penyangga jenuh dengan 2 -metil-1-Propanethiol (sebuah alkylsulfide), udara-teroksidasi sistein,atau hidrogen sulfida. Setiap percobaan mengakibatkanDMPO aduk yang memiliki konstanta membelah hyperfine serupadengan yang terdeteksi dalam isi kolon (Gambar 3). Putar menjebaksolusi ini tanpa menambahkan E. faecalis tidak menghasilkanradikal terdeteksi. Tidak semua senyawa yang mengandung sulfur,Namun, yang dihasilkan radikal. Beberapa upaya dilakukan untukmenghasilkan radikal menggunakan babi musin lambung (yang berisiproporsi yang signifikan dari residu sistein) dan sisteinsaja, tapi untuk alasan yang tidak jelas, masing-masing gagal. Temuan inimenyarankan bahwa E. faecalis menjajah usus membentuk tidakhanya oksigen berpusat radikal tetapi juga radikal thiyl.Kami memutuskan sebelah menilai dalam produksi vivoradikal oleh E. faecalis menggunakan hidroksilasi aromatikassay. Sekali lagi, metode ini dipilih karena keterbatasanmengukur radikal oleh perangkap berputar ESR. Tikusterjajah dengan E. faecalis dan dikelola D-fenilalaninsecara injeksi intraperitoneal. Setelah 1 jam, orto-, meta-, danpara-isomer dari tirosin yang diukur dalam urin (Gambar 4).Tambahan zat besi atau asam fitat tidak jelasberpengaruh pada produksi radikal hidroksil, karena tidak ada yang signifikanperbedaan yang ditemukan dalam konsentrasi orto-atau metaisomersuntuk diet ini dibandingkan dengan diet basal (Tabel 3).Konsentrasi para-isomer, yang berpotensidibentuk oleh racemase fenilalanin hidroksilase dan endogen,menurun untuk besi-dan fitat asam ditambahdiet dibandingkan dengan diet basal.Penelitian ini dirancang untuk mengatasi keterbatasanteknik ini dan langsung mengukur radikal di kolonisi menggunakan perangkap berputar ESR dan hidroksilasi aromatik.Meskipun perangkap berputar membutuhkan sampel pencampuran untukmenambahkan perangkap, Tris digunakan sebagai penyangga bukan EDTA (21)atau fosfat (41) untuk membatasi generasi artifactual dariradikal. Anehnya, radikal dominan yangditemukan menggunakan DMPO sebagai perangkap putar yang sulfur dan tidakoksigen berpusat spesies. Meskipun hyperfine membelahkonstanta untuk radikal thiyl bervariasi dari sampel ke sampel,menunjukkan spesies yang berbeda atau spesies tunggal sensitif terhadapperubahan kecil dalam lingkungan kolon, kesamaan lebih dariperbedaan yang diamati, terlepas dari diet.Radikal thiyl mungkin berasal dari musinyang berisi banyak subdomain sistein kaya (42),glutathione dari sel epitel gudang ke ususlumen (43), atau sistein kaya senyawa (misalnya, mycothiol)disintesis oleh mikroorganisme usus (44). Akhirnya,kolonisasi oleh bakteri yang menggunakan sulfat sebagai elektronakseptor dapat menghasilkan konsentrasi H2S di kolonlebih dari 1 mM (45, 46). In vitro, E. faecalis ditemukanmudah menghasilkan radikal thiyl di buffer jenuh denganH2S, udara-teroksidasi sistein, dan alkylsulfide 2-metil-1-Propanethiol. Ini aduk DMPO memiliki hyperfine membelahkonstanta mirip dengan yang terdeteksi di vivo (Gambar 3). Dengan demikian,berbagai senyawa usus endogen bisa berfungsi sebagaisumber potensial untuk radikal thiyl ditemukan di kolonisinya.Radikal Thiyl telah dijelaskan berikut sisteinoksidasi (47), di iradiasi larutan berair tiol (48-50),dan dari glutathione diinkubasi dengan xanthine oxidase atauperoksidase (51-53). Seperti radikal hidroksil, radikal thiylsangat reaktif dengan konstanta laju untuk oksigen yangmelebihi 109 M / detik (47). Reaktivitas tinggi ini membatasidifusi radikal ini untuk daerah tidak jauh melampaui merekasitus generasi. Meskipun radikal thiyl yang paling seringdianggap antioksidan dalam sistem biologis (54-56), merekareaktivitas kuat bisa dengan mudah merusak molekul seperti DNA(11, 12, 57-59). Selain itu, radikal ini mungkin memiliki lainnyaefek halus seperti isomerisasi cis-transester asam lemak tak jenuh tunggal untuk mengubah membran selfluiditas (60). Pentingnya radikal thiyl dalam karsinogenesis,Namun, sebagian besar masih belum diinvestigasi.Sebagai kesimpulan, temuan kami menunjukkan bahwa E. faecalismenjajah usus tikus menghasilkan campuran thiyl danoksigen berpusat radikal. Sebuah peran spesies oksigen reaktifdalam DNA kerusakan sebagian telah dirumuskan (3, 59), tetapiapa yang penting, jika ada, ini atau lainnya radikal ada dimanfaat karsinogenesis penyelidikan lebih lanjut. Itu tidakmuncul, bagaimanapun, bahwa suplementasi zat besi seperti yang dilaporkan dalampenelitian ini (; 20 mg / hari elemental zat besi per 250 g tikus) ataupeningkatan konsumsi asam fitat secara signifikan mengubahproduksi radikal bebas dalam lumen usus untuk tikusdijajah dengan bakteri ini memproduksi superoksida (Andini Marisyah Putri)