jurnal 4

Epigallocatechin-3-gallate, a Natural Polyphenol,
Inhibits Cell Proliferation and Induces

Apoptosis in Human Ovarian Cancer Cells
SUNITA D. RAO and KELLY PAGIDAS
Department of Obstetrics and Gynecology, Alpert Medical School of Brown University,
Women & Infants Hospital, Providence, RI, 02905, U.S.A.

Epigallocatechin-3-gallate, sebuah polifenol Alam, Menghambat Proliferasi Sel dan MenginduksiApoptosis pada Sel Kanker ovarium ManusiaEpigallocatechin-3-gallate (EGCG) adalah konstituen hadir polifenol dalam teh hijau sebelumnya menunjukkan untuk menghambat pertumbuhan kanker. Namun, studi tentang ovarium manusiakanker terbatas. Penelitian ini mengevaluasi, efek EGCG sebagai agen anti-proliferasi dan pro-apoptosis potensial dalam garis kanker ovarium manusia, Skov-3. Bahan dan Metode: Uji MTS yang mengukur aktivitas metabolisme sel-sel, bromodeoxyuridine (BrdU) assay penggabungan, dan aliran cytometry digunakan untuk studi proliferasi sel dan sel morfologi, analisis fragmentasi DNA dan TUNEL assay untuk efek apoptosis. Hasil: EGCG memperlakukan Skov- 3 sel menunjukkan penghambatan viabilitas sel dan proliferasi dalam dosis tergantung cara. Selanjutnya, EGCG-dimediasi Skov- 3 sel penghambatan pertumbuhan dikaitkan dengan perubahan apoptosis terbukti dari penangkapan siklus sel dan akumulasi sel-sel di fase apoptosis, perubahan morfologi sel, DNA fragmentasi dan Tunel-positif sel apoptosis.
Kesimpulan: Dalam Skov-3 sel, EGCG menghambat proliferasi sel melalui pengurangan sintesis DNA dan menginduksi kematian sel apoptosis melalui kerusakan DNA, sehingga mengelusidasi novel, masuk akal
mekanisme EGCG properti anti-tumorigenic. Teh yang berasal dari daun tanaman Camellia sinensis adalah
kedua minuman yang paling banyak dikonsumsi di dunia, kedua hanya untuk air. Teh telah dibudidayakan dan dikonsumsi untuk ribuan tahun (1). Di antara semua teh yang dikonsumsi di dunia, teh hijau tetap yang terbaik dipelajari untuk kesehatan potensial manfaat, termasuk efek antitumor terlihat dari manusia
epidemiologi, in vitro kultur sel dan studi model hewan (1-6). Sebagian besar dari efek antitumor dimediasi oleh polifenol (catechin) yang secara alami hadir dalam teh hijau. Epigallocatechin-3-gallate (EGCG) (Gambar 1) yang paling adalah catechin berlimpah dalam teh hijau dan menyumbang 50-80% dari kandungan polifenol yang mewakili 200-300 mg dalam diseduh cangkir teh hijau (3). EGCG menawarkan beberapa keuntungan sebagai agen antikanker diduga diberikan distribusi di mana-mana di alam, biaya rendah yang sesuai dan toksisitas minimal. Hal ini juga didokumentasikan bahwa EGCG memiliki efek antitumor pada sejumlah karsinoma dan garis sel kanker manusia (1, 3, 4, 7, 8). Oleh karena itu,
EGCG adalah agen terapi yang potensial untuk terapi kanker karena anti-proliferasi dan prodifferentiation
sifat dan kemampuan untuk menyebabkan apoptosis. Namun, studi tentang karsinoma ovarium manusia terbatas (9-14). 

 Kanker ovarium merupakan penyebab utama kematian dari semua karsinoma ginekologi (9). Prevalensi dan kematian kanker ovarium telah meningkat selama abad terakhir (15-16). Itu patogenesis penyakit ini masih harus dijelaskan dan agen terapi baru terus-menerus dieksplorasi. Di ini, bukti eksperimental / manusia yang ada di hijau asupan teh dan risiko kanker ovarium terbatas. Dalam kasus-kontrol dan studi kohort prospektif 3 tahun, melibatkan 254 pasien di Cina, Zhang et al. (9-10) menyimpulkan bahwa meningkatkan konsumsi teh hijau pasca-diagnosis kelangsungan hidup pasien kanker ovarium ditingkatkan 'dan meningkatkan frekuensi dan durasi konsumsi teh, khususnya teh hijau, mengurangi risiko terkena kanker ovarium. Oleh karena itu, upaya tambahan diperlukan untuk lebih menjelaskanefek antitumor kemungkinan EGCG pada kanker ovarium manusia. Dalam studi ini, anti-proliferasi dan pro-apoptosis potensi EGCG pada kelangsungan hidup sel, sintesis DNA, sel siklus, morfologi sel, fragmentasi DNA dan TUNELpositive sel apoptosis diperiksa dalam ovarium manusialini sel kanker, Skov-3.Bahan dan MetodeKultur sel. The Skov-3 sel diperoleh dari AmerikaKoleksi Budaya Tipe (Rockville, MD, Amerika Serikat). Kultur jaringanmedia dan serum janin sapi (FBS) yang dibeli dari Gibco(Carlsbad, CA, USA). EGCG dan semua reagen lainnya, kecualitempat yang ditentukan, yang dibeli dari Sigma Chemical Company(St Louis, MO, USA). EGCG dilarutkan dalam PBS dan disimpanpada -20 ˚ C. Garis sel SK0V-3 dipertahankan di Dulbecco inimenengah dimodifikasi Eagle (DMEM) ditambah dengan 10% FBS,penisilin (100 unit / ml), streptomisin (100 mg / ml) dan 1mMglutamin. Sel-sel dikultur pada 37 ˚ C dalam dilembabkansuasana di bawah 5% CO2. Media kultur sel berubahsetiap 48-72 jam. Untuk semua percobaan, kecuali dinyatakan lain,1 × 103 sel yang diunggulkan di piring 96-baik dan tumbuh pertemuanselama 24 jam, sebelum dirawat dengan EGCG atau pembawa pelarutPBS. Konsentrasi akhir EGCG digunakan untuk semua percobaandisusun oleh menipiskan saham dengan media kultur sel. ItuSel-sel kemudian diobati dengan baik kendaraan (PBS) atau EGCG padaberbagai konsentrasi selama 2 hari.Viabilitas sel. Uji MTS yang mengukur aktivitas metaboliksel digunakan untuk menentukan kelangsungan hidup sel EGCG yang diobatidibandingkan dengan kontrol menggunakan Cell titer 96 berair Satu SolusiProliferasi Assay kit (Promega Corporation, Madison, WI, USA).Viabilitas sel ditentukan secara spektrofotometri dengan mengukurkonversi substrat MTS ke produk formazon yangberbanding lurus dengan jumlah sel yang layak. Singkatnya, MTSreagen (10 ml / sumur) ditambahkan untuk kedua kendaraan dan EGCG diperlakukansel dan OD pada 490 nm tercatat setelah 4 jam menggunakan lempeng yangreader. Viabilitas sel dinyatakan sebagai persen dari sel-sel yang layak.Proliferasi sel. Bromodeoxyuridine (BrdU), sebuah thyamine, DNAprekursor analog penggabungan assay kit (Roche Diagnostics,Indianapolis, IN, Amerika Serikat), yang mengukur BrdU penggabungan di tempattimidin selama sintesis DNA sebelum pembelahan sel, digunakan untukmenentukan proliferasi sel EGCG yang diobati dibandingkan dengan kontrol.Singkatnya, baik kendaraan dan EGCG yang diobati sel diberi label denganBrdU (10 M) selama 6 jam sebelum inkubasi dengan anti-BrdU-peroksidase(POD) (10 ml / sumur) selama 2 jam. Kompleks kekebalan dideteksimenyusul penambahan trimetil benzidin substrat dan diukur pada450 nm menggunakan pembaca ELISA. Jumlah sel berkembang biak adalahdiwakili oleh tingkat BrdU penggabungan yang secara langsung berkorelasidengan intensitas warna dan nilai-nilai absorbansi. Proliferasi sel adalahdinyatakan sebagai% BrdU penggabungan.Analisis siklus sel. Arus cytometry digunakan untuk analisis siklus sel.Secara singkat, 3 × 105 sel dikultur dalam piring 6-baik dan diperlakukan denganEGCG (10 ug / ml) atau kendaraan (PBS) selama 2 hari. Kedua mengambangdan sel patuh dikumpulkan dan dicuci dua kali dengan PBS sebelumuntuk pewarnaan menggunakan propidium iodida (PI). Aliran cytometer FACScandan software Modfit (BD Biosciences, Mountain View, CA, USA)digunakan untuk akuisisi data dan daaata. Sepuluh ribu peristiwadianalisis untuk setiap sampel.Morfologi sel. Pengaruh EGCG pada morfologi sel adalahdipantau sebagai berikut: sel (5 × 106) yang diunggulkan di 48-baikpiring dan dirawat dengan baik kendaraan (PBS) atau EGCG (0-80 mg / ml)selama 2 hari. Sel-sel difoto (perbesaran × 10) denganKamera digital yang melekat pada mikroskop cahaya fase kontras (NikonEclipse TE2000-E, Tokyo, Jepang).Analisis fragmentasi DNA. Sebuah DNA apoptosis tangga kit (RocheDiagnostik) digunakan untuk menentukan fragmen DNA nuklirEGCG sel diobati dibandingkan dengan kontrol. Secara singkat, 1 × 106 sel yangdiunggulkan di T-25 termos dan diperlakukan dengan kendaraan (PBS) atau EGCG (40pg / ml selama 2 hari. Posting pengobatan, baik mengambang dan sel patuhHasilPengaruh EGCG terhadap proliferasi sel / survival. EGCGsecara signifikan menghambat kelangsungan hidup di Skov-3 sel dalam dosedependentcara (p <0,01) (Gambar 2). Selanjutnya, EGCG menghambat sintesis DNA secara dosis-tergantung sepertiterbukti dengan penurunan yang diamati dalam penggabunganBrdU ke dalam DNA dalam sel EGCG yang diobati dibandingkan dengankontrol (p <0,01) (Gambar 3).Pengaruh EGCG pada siklus sel. Analisis FACSmenunjukkan bahwa pengobatan dengan EGCG meningkatkanpersentase Skov-3 sel di G1-fase (Gambar 4 A)dengan penurunan terkait dalam persentase sel di Sphase(Sintesis DNA) (Gambar 4B) dan G2-fase (Gambar4C) dari siklus sel bila dibandingkan dengan yang tidak diobatikontrol. Selain itu, persentase sel dalamfase apoptosis meningkat jika dibandingkan dengankontrol (Gambar 4D).Pengaruh EGCG pada apoptosis. EGCG-dimediasi Skov-3penghambatan proliferasi sel / kelangsungan hidup dikaitkan denganperubahan apoptosis. Perbedaan morfologi yang diamatiantara EGCG yang diobati dan sel kontrol (Gambar 5Avs B, C, D, E, F). Pada konsentrasi EGCG mana penghambatandari proliferasi sel / kelangsungan hidup diamati (10-80 M), yangsel menyusut, bulat dan terpisah dari selbudaya substratum. Perubahan morfologi yangabsen dari sel kontrol (Gambar 5A). Selanjutnya, DNAfragmentasi / berjenjang (karakteristik apoptosis) adalahdiamati ketika sel-sel yang diperlakukan dengan EGCG, yang menunjukkankematian sel dengan apoptosis pada sel-sel sementara tidak ada DNAberjenjang diamati pada sel yang tidak diobati (kontrol)(Gambar 6). The TUNEL assay diidentifikasi inti oleh PI merahpewarnaan dan hijau tunel positif (apoptosis) inti yangdiidentifikasi oleh bintik-bintik kuning di PI dan TUNEL overlay.Banyak bintik-bintik kuning terlihat dalam sel EGCG-diobati,bila dibandingkan dengan sel kontrol (Gambar 7).DiskusiPenelitian sebelumnya (11, 12) dan penelitian ini menunjukkan bahwaEGCG menghambat kelangsungan hidup Skov-3 sel. Saat inipenelitian memiliki keuntungan bahwa uji MTS digunakan, yangmengukur aktivitas mitokondria sel. EGCG-diperlakukansel kehilangan kemampuan untuk menyediakan dan mempertahankan energi untukaktivitas metabolisme dan kelangsungan hidup menunjukkan bahwa EGCG menyebabkankerusakan sel. Replikasi DNA terjadi sebelum seldivisi / penggandaan, sehingga pengukuran sintesis DNA,adalah penanda yang menarik untuk proliferasi sel. PenurunanDNA BrdU-berlabel tercatat dalam sel diperlakukan EGCG,menunjukkan bahwa EGCG merupakan penghambat sintesis DNA danproliferasi sel di Skov-3 sel.Selain itu, persentase sel EGCG-dirawat difase apoptosis secara signifikan meningkat dibandingkan dengansel yang tidak diobati (Gambar 4D), menunjukkan blok dalam selperkembangan siklus yang menyebabkan kematian sel terprogram. Iniadalah sesuai dengan penelitian sebelumnya yang didirikanbahwa apoptosis adalah mekanisme kemungkinan tindakan tehpolifenol untuk menghambat pertumbuhan sel dalam berbagai karsinoma(1, 3, 5, 7). Dengan demikian, aktivasi apoptosis diyakinimemainkan peran penting baik dalam pencegahan kemoterapi danpengobatan karsinoma manusia. Perubahan morfologiterkait dengan apoptosis juga diamati dalam EGCG inidiperlakukan sel. Biokimia ciri apoptosis adalahfragmentasi DNA genomik, sebuah acara yang ireversibelmelakukan sel mati. Enzim endonuklease nuklirmemecah DNA menghasilkan fragmen DNA. EGCGpengobatan menyebabkan fragmentasi DNA (Gambar 6), lebih lanjutdikonfirmasi oleh uji TUNEL, label fragmen DNAdan menunjukkan bahwa EGCG menginduksi apoptosis dalam Skov-3sel dengan menyebabkan kerusakan DNA.Dalam penelitian terbaru, kombinasi ECGC dengan lisin,prolin, arginin dan asam askorbat ditunjukkan untuk menghambatlangkah-langkah penting dalam perkembangan kanker ovarium dan menyebar, seperti sebagai matriks metalloproteinase-2 sekresi dan invasi (14). Di kanker prostat DU-145 sel, kombinasi EGCG dan yang obat anti-inflamasi (OAINS), ibuprofen memiliki efek sinergis pada apoptosis (17). The sinergis efek EGCG dengan OAINS pada kanker ovarium tidak dikenal. Pada kanker ovarium, mekanisme didalilkan dari GCG efek anti-tumorigenic termasuk penurunan tingkat estrogen dan endotelin beredar. Data terakhir yang terbatas telah menghubungkan teh / EGCG asupan hijau untuk menurunkan beredar tingkat estrogen dan risiko kanker ovarium rendah pada manusia studi epidemiologi dan hewan (18), namun lebih studi diperlukan untuk lebih mengeksplorasi hubungan ini.Selanjutnya, endotelin-1 (ET-1) dan reseptor selektif ETA (Etar) yang diekspresikan dalam primer dan metastasis  karsinoma ovarium, bila dibandingkan dengan jaringan ovarium normal. Binding dari ET-1 untuk mengaktifkan reseptor Etar dan memicu pertumbuhan tumor, neoangiogenesis, penyerangan dan apoptosis perlindungan. Pretreatment jalur sel kanker ovarium HEY dan OVCA 433 dengan teh hijau dan EGCG menghambat ET-1 dan Etar ekspresi mRNA dan hilir sinyal jalur mengakibatkan pengurangan proliferasi sel, angiogenesis dan invasi (4, 13). EGCG tampaknya menjadi agen multifungsi diakui untuk antitumor, antiangiogenik, anti-metastasis dan anti-invasif properti. Singkatnya, anti-proliferasi dan proapoptotik sifat EGCG dalam garis sel kanker ovarium manusia, Skov-3, didukung oleh pengurangan diamati dalam sel sintesis kelangsungan hidup dan DNA, serta penangkapan siklus sel dan akumulasi sel-sel dalam fase apoptosis yang disebabkan oleh Kerusakan DNA.(Andini M.P)