jurnal 3

Structure-activity Studies of the Binding
of the Flavonoid Scaffold to DNA

PATRICIA A. RAGAZZON†, JIM ILEY and SOTIRIS MISSAILIDIS
Department of Chemistry and Analytical Sciences, The Open University, Milton Keynes, MK7 6AA, U.K.

Studi Struktur-aktivitas Bindingdari flavonoid scaffold pada DNA

 Abstrak. Latar Belakang: Flavonoid telah terbukti memiliki berbagai kegiatan biologis dan terbukti baikperancah untuk desain agen pengikat DNA sebagai antikanker terapi. Bahan dan Metode: Dalam struktur-aktivitas studi hubungan, turunan flavonoid yang dirancang dan disintesis melalui berbagai protokol sintesis organik, menghasilkan molekul novel atau dijelaskan sebelumnya. Ini dipelajari oleh absorbansi UV-Vis dan fluoresensi spektroskopi serta dialisis persaingan untuk mengikat mereka untuk Isoform DNA. Potensi sitotoksik mereka dinilai menggunakan MTS tes pada MCF-7 kanker payudara dan CCRFCEMbaris sel leukemia. Hasil dan Kesimpulan: Pengenalan gugus seperti klorida, nitrogen, asetoksi dan metoksikelompok tidak membantu untuk meningkatkan afinitas mengikat, tapi pengenalan mina tersier meningkatkan mengikat 1.000 kali lipat karena adanya meningkatkan interaksi senyawa dengan asam nukleat;penggantian oksigen oleh belerang meningkatkan mengikat 7 kali lipat, mungkin karena belerang yang kurang elektronegatif dibandingkan oksigen akan memungkinkan elektron dari molekul untuk berinteraksilebih kuat dengan asam nukleat. Penghambatan pertumbuhan dengan 50% (IG50) nilai yang moderat dalam payudara dan leukemia baris sel kanker mungkin karena flavonoid berinteraksi dengan komponen seluler lain selain asam nukleat. Tiga cincin aren terhubung dengan cara yang berbeda-beda dapat membentuk planarstruktur yang memiliki potensi untuk intercalate dalam DNA dan membentuk kompleks yang stabil. Prinsip ini telah menyebabkan desain banyak intercalators seperti Acridine (1), acridones (2), xanthines (3) dan lain-lain. Sebuah kelompok baru muncul agen antikanker didasarkan pada yang alami flavonoid. Penelitian mereka aktivitas biologis luas, dan mereka tidak hanya menunjukkan sifat antikanker pada berbagai jalur sel kanker (4, 5), tetapi mereka juga menunjukkan sifat chemopreventative (6), potensi penghambatan protein (7, 8) dan gangguan jalur yang berbeda dalam kaskade sel (9, 10). Senyawa seperti quercetin, baicalein, baicalin dan luteolin juga telah telah dipelajari untuk interaksi DNA mereka (11, 12), mereka intercalate double helix, mengikat istimewa lebih tinggi Agar struktur DNA seperti tripleks dan tetraplexes(Urutan telomeric manusia), dan memiliki konstanta pengikatan urutan 104 M-1 (lihat artikel sebelumnya dalam buku ini). Studi flavonoid dengan adanya ion logam (13) (Dan artikel sebelumnya dalam buku ini) melaporkan bahwa flavonoid juga berinteraksi dengan logam ketika mengikat DNA, dengan berbagaiefek tergantung pada senyawa dan hadir logam. Untuk beberapa, mengikat DNA berkurang, seperti flavonoid kompleks hanya dengan logam, sedangkan dalam kasus lain yang peningkatan mengikat dengan faktor hingga 104 lebih telah diamati (lihat artikel sebelumnya dalam buku ini). Diperkirakanbahwa logam mengikat keduanya flavonoid dan DNA, memungkinkan flavonoid untuk intercalate dan membentuk stabil kompleks dengan double helix (14, 15).Dalam makalah ini kami menjelaskan desain dan sintesis turunan flavonoid dan studi tentang interaksi mereka dengan DNA, dengan tujuan mengelusidasi preferensi mengikat dan potensi sitotoksik dalam upaya untuk mengidentifikasi senyawa timbal untuk pengembangan obat yang sedang berlangsung.Serapan UV-Vis dan spektroskopi fluoresensi. Saham solusi turunan flavon telah dibuat dengan melarutkan senyawa dalamDMSO untuk mencapai konsentrasi akhir 10 mM dan disimpan pada 4 ˚ C. Koefisien kepunahan setiap senyawa ditentukan pada pH 7,4 buffer fosfat (10 mM) yang mengandung EDTA (1 mM).Penyerapan dan spektrum fluoresensi diperoleh dengan menggunakanUVIKON UV / Visible spektrofotometer (NorthStar Ilmiah Ltd,Inggris) dan FluoroMax P fluorimeter (HORIBA, Jovin Yvon, Inggris).Hukum Beer-Lambert dipatuhi dalam rentang konsentrasidigunakan untuk kedua solusi obat dan DNA. Perubahan UV-Visspektrum penyerapan selama studi interaksi obat-DNA yangdiukur sebagai berikut: konsentrasi obat disesuaikan untuk memberikanabsorbansi ~ 0,5 (1 cm pathlength sel kuarsa), asam nukleatkonsentrasi meningkat dengan menambahkan 2 ml yang sesuainukleat larutan stok asam. Sebagai konsentrasi obat dalamOleh karena itu cuvette bervariasi, absorbansi dikoreksi dengan menggunakanrumus berikut: Abs = Absorig (1000 + V) / 1000, dimana V adalahvolume asam nukleat ditambahkan. Titik titrasi awal adalah UVspektrum dari obat bebas, eksperimental, titik titrasi akhirsesuai dengan ligan terikat sepenuhnya diperoleh olehmenambahkan volume asam nukleat sampai baik tidak ada perubahan lebih lanjut dalamabsorbansi diamati atau peningkatan serapan itu karenasemata-mata untuk absorbansi asam nukleat. Umumnya, absorbansipengukuran dilakukan pada panjang gelombang maksimum masing-masingflavon. Untuk pengukuran fluoresensi eksitasi dan emisicelah yang 5 dan 20 nm masing-masing. Untuk mendapatkan konstanta mengikat,Data absorbansi atau fluoresensi diperoleh dengan metode ini yang dilengkapidengan persamaan (24):di mana: absc adalah absorbansi dihitung, ABSF adalah absorbansi yangsepenuhnya terikat ligan, Abso adalah absorbansi dari ligan bebas, Abs adalahabsorbansi yang diamati, K adalah konstanta mengikat asosiasi, Dadalah konsentrasi obat dan n adalah situs mengikat per obatmolekul. Ketika data titrasi fluoresensi digunakan, ABSF mewakilinilai Fo / F sesuai dengan fluoresensi (F) dariflavon pada konsentrasi STDNA maksimum (obat yang terikat penuh),Abso sesuai dengan nilai Fo / F = 1 untuk obat gratis. Dalam keduasituasi, absc, K dan n nilai diperoleh dengan berulangpenyesuaian menggunakan program Asal 6.0 (Microcal, Inc), dengandiamati UV / fluoresensi data eksperimen diplot versuskonsentrasi molar asam nukleat.Kompetisi dialisis. Reservoir berisi pH 7,4 penyanggaterdiri dari 200 ml 6 mM Na2HPO4, 2 mM NaH2PO4, 185 mMNaCl, 0,1 mM EDTA, dan 1 M dari senyawa uji. Volume A0,5 ml masing-masing asam nukleat yang dipipet ke terpisah 0,5 mlDispoDialyser ® unit (SpectraPor, USA), yang ditempatkan diwaduk. Semua sampel asam nukleat adalah konsentrasi identik(75 M), dinyatakan dalam unit monomer (pasangan basa untukDNA duplex, triplet untuk tripleks DNA dan tetrad untuk tetraplexDNA). Gelas itu ditutupi dengan parafilm, dibungkus dalam aluminium foil, danisinya diperbolehkan untuk menyeimbangkan dengan pengadukan kontinu pada 4 ˚ Cselama 24 jam. Pada akhir periode equilibrium, sampel asam nukleathati-hati dipindahkan ke tabung microfuge, dan dibuat sampaikonsentrasi akhir 1% (b / v) sodium dodesil sulfat olehpenambahan volume yang sesuai dari larutan stok 10% (b / v). ItuKonsentrasi total setiap senyawa uji (Ct) dalam setiap dialisisUnit kemudian ditentukan secara spektrofotometri menggunakankoefisien kepunahan yang tepat. Gratis konsentrasi ligan adalahditentukan secara spektrofotometri menggunakan alikuot dialisatsolusi dari reservoir.Sel. Populasi klonal MCF-7 dan CCRFCEM sel yang digunakandalam percobaan ini. Sel-sel secara rutin tumbuh di RPMIglutamax(SIGMA) ditambah dengan 10% dan 5%, untuk setiap selketik masing-masing, panas-dilemahkan serum janin anak sapi (GIBCO,Invitrogen) pada 37 ˚ C, dan 6% CO2 di udara. Sel-sel disubkulturdua kali seminggu.MTS sel uji proliferasi. The Cell Titer 96 ® berair Non-Radioaktif your Proliferasi Assay (Promega, cat # G1112) adalahMetode kolorimetrik untuk menentukan jumlah sel yang layak dalamproliferasi. Senyawa tetrazolium (3 - (4,5-dimethylthiazol-2-il) -5 - (3-carboxymethoxyphenyl) -2 - (4-sulfophenyl)-2Htetrazolium,garam dalam) (MTS) dilarutkan dalam PBS penyangga dankopling reagen elektron (metosulfat phenazine) (PMS) adalahditambahkan sesuai dengan protokol yang disediakan. Sel ditumbuhkan dalam 96baik piring (0,2 ml) ke konsentrasi awal 1 × 104 sel / ml dalammedia yang sesuai selama 24 jam pada 37 ˚ C dan 6% CO2 di udara.Periode inkubasi 24, 48 dan 72 jam dengan 0, 1, 3, 10, 30, 100, 300dan 1.000 M dari senyawa uji dilanjutkan. Setelahprotokol yang ditentukan, 40 ml larutan MTS-PMS yang ditambahkan kesetiap solusi inkubasi dan selanjutnya diinkubasi pada suhu 37 ˚ C dan CO2 6%di udara selama 2 jam sebelum membaca. Pembacaan tercatat sebesar 490 nm.Hasil dan PembahasanKimia. Gambar 1 menunjukkan jalur umum diikuti dalampenelitian ini untuk sintesis flavon, sedangkanGambar 2 mengilustrasikan kimia digunakan untuk mensintesisturunan dari chrysin (untuk daftar lengkap dari senyawa melihatTabel I). Sintesis flavon dengan metode umumterbukti biasa-biasa saja, kecuali untuk sistem bantalangugus hidroksil tambahan. Untuk ini, produk utamaterisolasi dari langkah pertama adalah derivatif over-benzoylatedyang mengganggu proses penataan ulang berikutnya dalamlangkah (ii), dan hasil dari produk yang diinginkan biasanya dalamkisaran 1-2%, bahkan menggunakan Jain dan pendekatan yang Makrandi (25). Masalah ini dipecahkan, sebagian, bila menggunakan terhidroksilasi 2-hydroxyacetophenones sebagai bahan awal, Desain obat dapat digunakan untuk memahami analog obat yang penggunaan terbaik fitur tertentu DNA struktur untuk memaksimalkan interaksi dan meningkatkan spesifisitas. Pendekatan rancangan obat rasional telah memungkinkan kita untuk emperkenalkan gugus yang berbeda ke dalam kerangka flavon, mensintesis dan mempelajari afinitas derivatif tersebut untuk DNA. Hasil menunjukkan bahwa amina tersier dan gugus hidroksil adalah kelompok yang paling tepat untuk meningkatkan pengikatan DNA, meningkatkan konstanta mengikat urutan 106 M-1. Pengenalan kloro-dan nitrogroups tidak meningkatkan mengikat helix dupleks STDNA, sedangkan substitusi dengan metoksi dan asetoksi kelompok mengurangi konstanta mengikat diperoleh. Penggantian gugus karbonil oleh belerang meningkat afinitas flavon untuk DNA oleh 7 kali lipat. Kompetisi percobaan dialisis menunjukkan preferensi yang luar biasa untuk struktur orde tinggi DNA (seperti G-quadruplex dan triplexes) sebagai struktur cincin 3 mungkin lebih baik ditampung dalam struktur ini. Logam kation membantu pada meningkatkan pengikatan obat untuk DNA, terutama ketika kemudian menanggung gugus hidroksil pada posisi 7. Itu Hasil uji viabilitas sel menunjukkan bahwa antikanker Kegiatan tidak signifikan ditingkatkan dengan berbagai substitusi, meskipun mengikat ditingkatkan dengan1000-kali lipat, menunjukkan bahwa DNA-mengikat tidak langsung terkait dengan aktivitas antikanker untuk molekul tersebut. Namun, faktor-faktor lain seperti metabolisme, serapan seluler, obat persistensi, sitotoksisitas, dan reaksi mungkin dengan komponen seluler juga bisa bertanggung jawab untukjelas kurangnya aktivitas antikanker (Andini Marisyah Putri)