jurnal 10The Major Green Tea Polyphenol, (-)-Epigallocatechin-3-Gallate, Inhibits Obesity, Metabolic Syndrome, and Fatty Liver Disease in High-Fat–Fed Mice

Mousumi Bose,3,5 Joshua D. Lambert,3,6 Jihyeung Ju,3 Kenneth R. Reuhl,4 Sue A. Shapses,5
and Chung S. Yang3,5*
3Department of Chemical Biology and 4Department of Pharmacology and Toxicology, Ernest Mario School of Pharmacy, Rutgers,
the State University of New Jersey, Piscataway, NJ 08854; and 5Graduate Program of Nutritional Sciences, Rutgers,
the State University of New Jersey, New Brunswick, NJ 08901


Mayor dari Polifenol teh Hijau  (-)-Epigallocatechin-3-gallate, Menghambat Obesitas,Sindrom metabolik, dan Fatty Liver Disease pada Tikus Tinggi Lemak-Fed

Dalam studi ini, kami meneliti efek teh hijau utama polifenol, (-)-epigallocatechin-3-gallate (EGCG), pada highfat- diinduksi obesitas, gejala dari sindrom metabolik, dan perlemakan hati pada tikus. Pada tikus yang diberi diet tinggi lemak (energi 60%
sebagai lemak), suplementasi diet dengan pengobatan EGCG (3,2 g / kg diet) selama 16 minggu mengurangi berat badan (BW) gain tubuh, persen
lemak tubuh, dan berat lemak visceral (P, 0,05) dibandingkan dengan tikus tanpa EGCG pengobatan. BW Penurunan itu
dikaitkan dengan peningkatan lipid tinja dalam kelompok tinggi lemak-makan (r2 ¼ 0,521, P, 0,05). EGCG pengobatan insulin dilemahkan
resistensi, kolesterol plasma, dan konsentrasi protein chemoattractant monosit dalam tinggi lemak-makan tikus (P, 0,05).
EGCG pengobatan juga mengalami penurunan berat hati, trigliserida hati, dan alanin aminotransferase konsentrasi plasma
tinggi lemak-makan tikus (P, 0,05). Analisis histologis sampel hati mengungkapkan penurunan akumulasi lipid dalam hepatosit
pada tikus diperlakukan dengan EGCG dibandingkan dengan diet tinggi lemak-makan tikus tanpa EGCG pengobatan. Dalam eksperimen lain,
3-mo berusia tikus-lemak-induced tinggi obesitas menerima pengobatan EGCG jangka pendek (3,2 g / kg diet, 4 minggu) mengalami penurunan mesenterika
Berat lemak dan glukosa darah dibandingkan dengan tikus kontrol tinggi lemak-makan (P, 0,05). Hasil kami menunjukkan bahwa EGCG dalam jangka panjang
pengobatan dilemahkan perkembangan obesitas, gejala yang berhubungan dengan sindrom metabolik, dan perlemakan hati.
Pengobatan EGCG jangka pendek muncul untuk membalikkan sudah ada lemak-induced tinggi patologi metabolisme pada tikus gemuk.
Efek ini dapat dimediasi oleh penurunan penyerapan lipid, inflamasi menurun, dan mekanisme lainnya.
Pengantar
Tingkat obesitas, yang didefinisikan sebagai BMI $ 30 kg/m2, telah meningkat
secara dramatis di Amerika Serikat di masa lalu 20 y dan terutama
dalam 10 y lalu (1). Ada hubungan positif yang kuat antara
obesitas dan diabetes tipe II, penyakit jantung, dan hipertensi
(2). Asosiasi ini menggambarkan sindrom metabolik,
pengelompokan faktor risiko termasuk obesitas perut, insulin
resistensi, dan dislipidemia. Sindrom metabolik juga sering
ditandai oleh peradangan kronis dan steatosis hati (3).
Teh hijau yang dikonsumsi di seluruh dunia, khususnya di Asia Timur
negara. Teh hijau mengandung kafein dan polifenol senyawa
dikenal sebagai catechin. Yang paling berlimpah catechin ditemukan
dalam teh hijau adalah (-)-epigallocatechin-3-gallate (EGCG), yang memiliki 7
telah disarankan untuk bertanggung jawab untuk banyak kesehatan potensial
efek teh (4,5).
Pada tahun 1999, Dulloo et al. (6) menemukan bahwa pemberian hijau
ekstrak teh signifikan meningkatkan pengeluaran energi dan lemak
oksidasi dalam kelompok laki-laki muda. Sejak itu, beberapa klinis
percobaan telah melaporkan efek persiapan teh pada peningkatan
pengeluaran energi, oksidasi lemak, penurunan berat badan, massa lemak, dan
pemeliharaan berat badan setelah penurunan berat badan (7-9). Namun demikian,
apakah efek ini disebabkan katekin atau kafein belum
diselesaikan. Beberapa penelitian pada hewan model menunjukkan bahwa hijau
ekstrak teh penurunan berat badan dan mendapatkan lemak tubuh (10,11). Di
2005, melaporkan bahwa pengobatan dengan TEAVIGO, teh hijau
ekstrak berisi $ 94% EGCG dan # 0,1% kafein, secara signifikan mengurangi berat badan (BW) dan lemak tubuh yang berbeda
strain tikus yang diberi diet tinggi lemak (12,13).
Selain efek penurunan berat badan nya, ada penelitian yang memiliki
menyarankan bahwa mengkonsumsi teh dapat mengurangi metabolisme lainnya
kelainan yang berhubungan dengan obesitas. Beberapa penyelidikan klinis
menunjukkan bahwa perlakuan teh mengurangi glukosa darah puasa dan
toleransi glukosa membaik pada subyek sehat dan diabetes
(14,15) uji klinis arecent melaporkan. Bahwa ketika subyek sehat
diberi ekstrak hijau, hitam, dan teh murbei
bersamaan dengan tinggi pati dan lipid-makan, karbohidrat
penyerapan secara signifikan tumpul (16).
Ada beberapa penelitian yang menjelaskan efek menguntungkan dari
konstituen teh pada model binatang dari sindrom metabolik
(15,17). Satu studi melaporkan bahwa pemberian oral EGCG
selama 3 minggu secara signifikan mengurangi tekanan darah dan meningkatkan
sensitivitas insulin pada tikus hipertensi spontan (18). A
penelitian terbaru oleh Wolfram et al. (19) melaporkan bahwa TEAVIGO
toleransi glukosa secara signifikan meningkatkan pengobatan dan insulin
sensitivitas dalam db / db tikus.
Steatosis hati (atau penyakit hati berlemak nonalkohol) dan
peradangan tingkat rendah kronis adalah 2 kondisi yang berhubungan
dengan obesitas dan sindrom metabolik (3,20). Hijau
Konsumsi teh telah terbukti berkorelasi terbalik dengan
kerusakan hati (konsekuensi dari steatosis hati progresif) dan
dengan tanda peradangan pada manusia (21,22). Dalam tinggi lemak-
makan C57BL/6J dan leptin-kekurangan ob / ob tikus gemuk, teh hijau
pengobatan mengurangi lipid hati dan penanda kerusakan hati
(10,23).
Efek dari dosis fisiologis yang relevan dari EGCG pada
obesitas dan lemak-induced tinggi patologi yang terkait dengan
sindrom metabolik belum sistematis dipelajari. Itu
tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui pengaruh EGCG diet
pada berat badan, penanda resistensi insulin, steatosis hati,
dan penanda inflamasi dalam tinggi lemak tikus diet-induced
model untuk obesitas dan syndrome.We metabolik dipelajari baik
efek jangka panjang EGCG dalam menumbuhkan tikus tinggi lemak-makan dan
efek jangka pendek EGCG pada tikus gemuk 3-mo-tua.
Bahan dan Metode
Kimia dan diet
EGCG adalah hadiah dari Mitsui Norin. Komersial diet rendah lemak (LF; 10%
energi sebagai lemak), diet tinggi lemak (HF, energi 60% sebagai lemak), dan tinggi lemak ditambah
EGCG (HFE, energi 60% sebagai lemak, 3,2 g EGCG / kg diet) Diet (Tabel 1) adalah
disiapkan oleh Diet Research. Secara singkat, masing-masing bahan ditimbang (dalam
0,5% dari jumlah yang dibutuhkan) dan dicampur untuk homogenitas dalam yang sesuai
bubuk diet. Campuran tersebut kemudian dibentuk menjadi pelet berukuran sama
dan ditempatkan dalam ruang suhu dan kelembaban yang dikendalikan untuk menghapus
kelembaban dari diet.
Pengobatan Diet
Jangka panjang administrasi diet EGCG (Expts. 1 dan 2). Semua
hewan percobaan dilakukan sesuai dengan protokol yang disetujui oleh
Kelembagaan Perawatan Hewan dan Penggunaan Komite di Rutgers University
(Piscataway, NJ). Seratus pria C57BL/6J tikus (umur 5-6 minggu) dari
baik koloni peternakan departemen atau Jackson Laboratorium yang
digunakan dalam 2 percobaan jangka panjang. Pertama pengobatan jangka panjang (Expt. 1,
n ¼ 38, 6 minggu tua) dirancang untuk menentukan efek EGCG pada BW
dan lemak tubuh pada tikus tinggi lemak-makan. The 2nd pengobatan jangka panjang (Expt. 2,
n ¼ 56, 5 wk tua) dirancang untuk mengkonfirmasi temuan pada BW dan lemak
dari Expt. 1 dan juga untuk menentukan dampak EGCG pada lipid tinja,
hiperglikemia, resistensi insulin, tanda peradangan, dan lemak
hati yang disebabkan oleh diet tinggi lemak. Dalam kedua studi, tikus diberi LF, HF, atau
HFE diet selama 16 minggu. Berdasarkan skala alometrik, dosis saat ini digunakan
dari 3,2 g / kg diet pada tikus sesuai dengan 10 cangkir 200 ml teh hijau
(Berisi 2 daun teh g per cangkir) per hari untuk rata-rata orang
membutuhkan 8374 kJ (2000 kkal) / d. BW dan asupan makanan (pada per-kandang
dasar) yang diukur setiap minggu. Untuk pengukuran lipid kotoran dari Expt. 2,
seprai kandang berubah selama wk 10 dan kotoran dikumpulkan dari
kandang hari berikutnya.
Pengobatan diet jangka pendek dari EGCG (Expt. 3). Untuk menentukan
efek jangka pendek dari EGCGon tinggi lemak-makan tikus (Expt. 3), 5 - 6-minggu-tua
tikus C57BL/6J jantan diberi makan baik LF (n ¼ 9) atau HF (n ¼ 18) diet untuk
9 minggu, setelah itu, 10 tikus dari kelompok HF secara acak dipetik dan
beralih ke HFE diet. Tikus diobati dengan diet untuk tambahan
4 minggu. BW dan asupan makanan (pada basis per kandang) yang diukur setiap minggu.
Glukosa darah
Hari onthe pengukuran glukosa darah, makanan telah dihapus dan kandang
seperai berubah (untuk meminimalkan coprophagy) 7-8 jam sebelum pengukuran.
Darah dikumpulkan dari vena ekor dan konsentrasi glukosa
diukur dengan OneTouch memantau glukosa Dasar (Lifescan).
Glukosa darah (dari makanan-kekurangan tikus) diukur 6 kali sepanjang
jalannya Expt. 2. Untuk Expt. 3, glukosa darah diukur 3 kali
sepanjang perjalanan penelitian, dua kali sebelum tikus dipindahkan
ke HFE diet (pada minggu 4 dan 7 penelitian) dan sekali pada akhir penelitian
(Pada minggu 13).
Tissue panen
Untuk Expt. 1, tikus adalah makanan dirampas selama 6 jam sebelum membunuh setelah 16 minggu dari
pengobatan. Mencit ditimbang dan dibunuh oleh CO2 overdosis. Jumlah persen
lemak tubuh diukur postmortem dengan dual-energi X-ray absorptiometry
menggunakan PIXImus densitometer (Lunar GE Medical Systems). Mendalam
jaringan adiposa (mesenterika, epididimis, dan retroperitoneal depot) yang
dipanen, dibilas, dan ditimbang.
Untuk Expt. 2, tikus adalah makanan dirampas dan dibunuh seperti dijelaskan di atas.
Seluruh darah diperoleh melalui pungsi jantung. Jaringan adiposa viseral
(Mesenterika, epididimis, dan retroperitoneal depot) dan hati yang
dipanen, dibilas, dan ditimbang. Fatty liver awalnya didiagnosis dengan
diubah warna (warna merah muda karena akumulasi lipid) dan kemudian
dikonfirmasi oleh analisis histologis (kriteria yang dijelaskan di bawah). Salah satu lobus hati itu tetap dalam formalin 10%, sisanya adalah snap-beku kering
es. Plasma diisolasi dengan sentrifugasi pada 700 3 g di kamar
temperatur; 15 menit, dan snap-beku es kering. Semua sampel beku
disimpan pada 280? C.
Untuk Expt. 3, semua tikus dari LF, HF, dan HFE kelompok ditimbang
dan dibunuh oleh CO2 overdosis setelah 13 minggu pengobatan. Adiposa viseral
jaringan (mesenterika, epididimis, dan retroperitoneal depot) yang
dipanen, dibilas, dan ditimbang.
Analisis biokimia dari sampel plasma
Semua sampel dianalisis pada tikus makanan dirampas berasal dari Expt. 2. Plasma
insulin ditentukan dengan ELISA (Millipore). Plasma kolesterol
ditentukan oleh Kolesterol E kit (Wako Diagnostik). Plasma monosit
chemoattractant protein 1 (MCP-1) ditentukan dengan ELISA (R & D
Sistem). Plasma tumor necrosis factor-a dan interleukin-6 (IL-6) yang
ditentukan dengan ELISA (Invitrogen). Plasma SGPT
(ALT) konsentrasi ditentukan secara spektrofotometri menggunakan
ALT DiscretePak dari Catachem.
Perhitungan model penilaian homeostasis
resistensi insulin
Model penilaian homeostasis resistensi insulin (HOMA-IR) adalah
dihitung dengan menggunakan glukosa darah akhir dan penentuan insulin
makanan-kekurangan tikus dari Expt. 2. Metode ini banyak digunakan untuk memperkirakan
resistensi insulin pada manusia dan model hewan (24). Berikut
Rumus diaplikasikan (25):
Resistensi insulin ¼
ðmmol glukosa? L21Þ3insulin DMU? L21Þ
22:05
:
Analisis lipid tinja
Untuk penentuan lipid kotoran, kotoran (0,9-1,3 g) dikumpulkan selama 10 minggu
dari Expt. 2 ditimbang, ditambahkan ke dalam air 3-4mLdeionized, dan dibiarkan
duduk di 4? C semalam. Hari berikutnya, campuran kotoran dihomogenisasi
dengan vortexing. Setelah vortexing, lipid diekstraksi dengan
metanol: kloroform (2:1, v: v) menggunakan metode yang dijelaskan sebelumnya (26).
Lapisan lipofilik dari ekstraksi dikumpulkan dan dikeringkan di bawah
vakum. Jumlah lipid diukur gravimetri.
Pengukuran trigliserida hati
Untuk penentuan hati trigliserida pada tikus dari Expt. 2, hati
jaringan (50-100 mg) dihomogenisasi dalam 2 mL isopropanol dengan
Polytron pengganggu. Homogenat disentrifugasi pada 2000 3 g;
10 menit, dan supernatan dikumpulkan. Trigliserida dalam supernatan
diukur dengan Trigliserida H kit (Wako Diagnostik).
Hati histopatologi
Tertanam blok jaringan hati dari Expt. 2 dipotong menjadi 6-mikron
bagian dan diwarnai dengan hematoxylin dan eosin. Mounting menengah dan
slip penutup ditempatkan pada slide, yang kemudian dibiarkan mengering
semalam. Diagnosis fatty liver dibuat berdasarkan adanya
makro atau lemak microvesicular di .5% dari hepatosit dalam slide tertentu.
Analisis statistik
Analisis statistik dilakukan dengan menggunakan software Prism GraphPad. OnewayANOVAwith
Tukey post hoc test digunakan untuk analisis statistik
BW gain, lemak tubuh, dan pengukuran biokimia. Untuk analisis BW
dan glukosa darah selama periode waktu perawatan, diulang-langkah
ANOVA dengan post test Bonferroni hoc digunakan. Sebuah uji chi-square adalah
dilakukan untuk analisis kejadian perlemakan hati. Korelasi Pearson
Koefisien ini digunakan untuk analisis korelasi antara lipid dan fecal
BW perubahan. Semua data disajikan sebagai berarti 6 SEM. Signifikansi
ditugaskan di P, 0,05.
Hasil
Efek pengobatan EGCG jangka panjang pada asupan makanan, BW,
dan lemak tubuh. Asupan makanan harian per kandang tidak berbeda antara
kelompok baik dalam percobaan jangka panjang (data tidak ditampilkan). Untuk
Expt. 1 (Gambar 1A) dan Expt. 2 (Gambar 1C), HFmice secara signifikan
berat daripada tikus LF oleh wk 3-4 pengobatan. Kecenderungan ini
tetap sepanjang perjalanan masa pengobatan. Dengan
akhir masa pengobatan 16-minggu, HFE tikus ditimbang secara signifikan
kurang dari HF tikus (Gambar 1 A, C). BW gain adalah 33-41%
lebih rendah pada tikus HFE (Expt. 1:, 14.02 6 2.67 g; Expt 2, 19,21 6.
2.06 g) dibandingkan withHF tikus (Expt. 1, 23.8060.11 g;. Expt 2,
30,48 6 0,90, P, 0,05).
Hasil dari X-ray absorptiometry dual-analisis energi
menunjukkan bahwa tikus HF menunjukkan peningkatan signifikan persen
lemak tubuh (49,95 6 0,98%) dibandingkan dengan tikus LF (19,16 6
1,36%). HFE tikus memiliki signifikan lebih rendah persen lemak tubuh
(Untuk 44,77 6 2,06%) dibandingkan dengan tikus HF. Tikus HF telah meningkat secara signifikan total berat adiposa viseral dibandingkan
dengan tikus LF di kedua Expts. 1 (Gambar 1B) dan 2 (Gambar 1D) Untuk Expt.
1, pengobatan EGCG mengurangi berat adiposa mesenterika
depot (19% penurunan) dan depot adiposa retroperitoneal (21%
penurunan) di HF tikus (Gambar 1B). Dalam Expt. 2, EGCG pengobatan
mengurangi total visceral adipose berat jaringan sebesar 37% pada tikus HF
(P, 0,05;. Gambar 1D). Hal ini dipicu penurunan berat badan
mesenterika (48% penurunan), epididimis (28% penurunan), dan
retroperitoneal (34% penurunan) depot (P, 0,05 untuk semua depot;
Gambar. 1D). Diskusi
Dalam penelitian ini, 16-minggu pengobatan EGCG diet secara signifikan
menurun BW pada tikus yang diberi diet tinggi lemak. Ini adalah
jelas dalam kedua percobaan jangka panjang (Expts. 1 dan 2). BW
keuntungan lebih besar di Expt. 2 dibandingkan dengan Expt. 1, ini mungkin memiliki
terjadi karena fakta bahwa tikus di Expt. 2 muda di
memulai pengobatan.
Penelitian sebelumnya telah menunjukkan bahwa EGCG pengobatan (5-10 g
EGCG / kg diet) mengurangi BW pada tikus yang diberi diet tinggi lemak (12,13).
Yang saat ini digunakan dosis 3,2 g EGCG / kg diet pada tikus, yang
sesuai dengan 10 200-mL cangkir teh hijau (yang mengandung 2 g teh
daun per cangkir) per hari, mungkin merupakan dosis lebih terjangkau
daripada yang sebelumnya dilaporkan dalam studi penurunan berat badan dengan hewan
model. Studi masa depan diperlukan untuk menentukan apakah ada
efek dosis-respon EGCG pada berat badan yang diproduksi oleh
diet tinggi lemak.
Kami menemukan bahwa 16-minggu pengobatan EGCG juga secara signifikan
penurunan total persen lemak tubuh dan lemak visceral berat badan.
Penurunan lemak tubuh visceral oleh EGCG jelas dalam
mesenterika, epididimis, dan retroperitoneal depot, dengan
Penurunan terbesar terjadi di depot mesenterika. Ini
penurunan lemak tubuh mungkin karena EGCG menghambat lipid
penyerapan atau meningkatkan oksidasi lemak. Memang, kami menemukan bahwa
pengobatan EGCG jangka panjang meningkat lipid tinja dengan EGCG
pengobatan dibandingkan dengan tikus kontrol tinggi lemak-makan, mendukung
hipotesis bahwa EGCG mengalami penurunan penyerapan lipid (Andini Marisyah Putri)

Jurnal 9

Effects of Iron and Phytic Acid
on Production of Extracellular Radicals

by Enterococcus faecalis

DANNY R. MOORE,* YASHIGE KOTAKE, AND MARK M. HUYCKE*,1
*The Muchmore Laboratories for Infectious Diseases Research, Research Service,
Department of Veterans Affairs Medical Center, and Department of Medicine,
University of Oklahoma Health Sciences Center, Oklahoma City, Oklahoma 73104;
Free Radical Biology and Aging Research Program, Oklahoma Medical Research Foundation,
Oklahoma City, Oklahoma 73104

Pengaruh Asam Besi dan fitat pada Produksi Radikal Ekstraseluler
oleh Enterococcus faecalis

 Enterococcus faecalis adalah komensal usus manusia yangmenghasilkan superoksida ekstraselular, hidrogen peroksida, danradikal hidroksil sementara menjajah saluran usus. Untukmenentukan apakah faktor makanan terlibat dalam kolorektalkanker mempengaruhi produksi oksidan oleh E. faecalis, radikal yangdiukur pada tikus dijajah dengan mikroorganisme ini sementaradiet dilengkapi dengan besi atau asam fitat. Radikal hidroksilKegiatan diukur dengan pengujian untuk hidroksilasi aromatikproduk D-fenilalanin menggunakan fase-balik kinerja tinggikromatografi cair dan deteksi elektrokimia. Divitro, seperti yang diharapkan, besi ditingkatkan, dan asam fitat menurun,pembentukan radikal hidroksil oleh E. faecalis. Untuk tikus dijajah denganE. faecalis diberikan zat besi tambahan (740 mg elementalbesi sebagai fosfat besi per kg diet) atau asam fitat (1,2% b / b),ada perbedaan yang ditemukan dalam konsentrasi urin orto-ataumeta-isomer D-fenilalanin dibandingkan dengan tikus pada basaldiet. Radikal berair isi kolon yang lebihdinilai ex vivo dengan resonansi spin elektron menggunakan 5,5 -dimetil-1-pyrroline-N-oksida sebagai perangkap spin. Campuran thiyl(Sulfur-centered) dan oksigen berpusat radikal terdeteksidi semua diet. In vitro, spektrum yang sama diamati ketika E.faecalis diinkubasi dengan hidrogen sulfida, ber-teroksidasisistein, atau alkylsulfide, sebagai khas senyawa yang mengandung sulfuryang mungkin terjadi di isi kolon. Sebagai kesimpulan,kolonisasi usus dengan E. faecalis dalam model tikus menghasilkanradikal baik thiyl dan oksigen yang berpusat di isi kolon.Pembentukan radikal, bagaimanapun, tidak signifikan diubah olehsuplemen makanan jangka pendek dengan besi atau asam fitat. ExpBiol Med 229:1186-1195 2004Kata kunci: Enterococcus faecalis, radikal bebas, zat besi, dietasam fitat, hidroksilasi aromatik, resonansi spin elektronspektroskopiSetiap tahun pada basis global hampir satu juta orangdidiagnosis dengan kanker kolorektal (CRC), danini lebih dari setengah mati akibat komplikasi (1). ItuPeran flora komensal usus dalam etiologi CRCtelah memperoleh perhatian meningkat dalam beberapa tahun terakhir (2). Satubakteri pada khususnya, Enterococcus faecalis, telahdisarankan sebagai penyebab potensial CRC melaluiproduksi superoksida ekstraseluler (2, 3). Anionik inilead radikal oksidan kuat lainnya seperti hidrogenperoksida dan radikal hidroksil. Ini oksigen reaktifspesies telah terdeteksi dalam isi usus darihewan dijajah oleh E. faecalis (4, 5) dan dapat meningkatkantransformasi sel epitel melalui kerusakan oksidatifDNA (3). Namun, masih harus ditentukan apakahbacterially dimediasi stres oksidatif pada ususepitel berperan dalam karsinogenesis kolorektal.Ini fenotipe bakteri yang unik, yaitu, produksiradikal ekstraseluler, dinyatakan oleh mayoritas E.faecalis isolat dari feses normal, tetapi beberapa lainnya ususcommensals (6). Enterococcus faecalis strain yang menghasilkansuperoksida ekstraseluler umumnya menjajah manusiasaluran usus (6), meskipun, secara keseluruhan, terdiri enterococci, 1% dari total flora yang fecal (7-9) dan tidak biasanyagenus dominan. In vitro dan in vivo dari pembentukanekstraseluler superoksida oleh E. faecalis telah terbuktikerusakan DNA sel epitel kolon, mungkin melaluihidrogen peroksida derivatif yang berdifusi ke dalam sel (10).DNA bisa dioksidasi oleh hidrogen peroksida melaluigenerasi radikal hidroksil pada situs di mana DNAterkait dengan besi (11):Fe2þ þ þ hth H2O2! Fe3þ þ? OH þ H2O Lain peristiwa biologis merusak, di sampingReaksi Fenton ditampilkan di sini, dapat diprakarsai oleh superoksida.Misalnya, superoksida diketahui menyebabkan peroksidasipolyunsaturated asam lemak dalam membran sel epitel.Hal ini, pada gilirannya, dapat menyebabkan pembentukan kerusakanproduk seperti 4-hidroksinonerial dan malondialdehid yangsecara bebas diffusible dan sangat mutagenik (12).Besi merupakan katalis penting dalam reaksi redoks danOleh karena itu faktor risiko potensial untuk CRC melalui pro-oksidanmekanisme (13-16). Zat besi atau besi diambil terapisebagian besar diserap oleh usus. Sebagian masuk ke dalamusus besar, di mana, dalam teori, bisa menghasilkan hidroksilradikal di hadapan superoksida atau hidrogen peroksida.Dalam model di mana hewan secara kronis terpaparsuplemen zat besi, yang peroksidasi dari epitel ususpeningkatan lipid sel, dan sel crypt menunjukkan hiperproliferatifperubahan (17, 18). Akhirnya, studi epidemiologi menunjukkan,meskipun tidak konsisten, risiko lebih besar untuk CRC denganmeningkatkan zat besi atau besi total tubuh (15). Berbeda denganbesi sebagai faktor risiko potensial untuk CRC, asam fitat atau myoinositolhexakisphosphate adalah agen antikanker yang potensial(19, 20). Meskipun efek dari asam fitat yang pleiotrophic,salah satu fitur yang menonjol adalah kemampuannya untuk chelate besidan menghambat reaksi Fenton (21). Asam fitat tertelanmungkin membatasi kerusakan oksidan pada epitel usus dengan inimekanisme.Dalam studi ini, kami menilai efek dari besi dan fitatasam terhadap produksi radikal oleh E. faecalis in vitro dan sebagaisuplemen makanan dalam terjajah tikus. Radikal Ususterdeteksi oleh hidroksilasi aromatik D-fenilalanindan melalui berputar resonansi (ESR) spin elektronmenjebak. Hasil kami menunjukkan bahwa besi dan asam fitat,walaupun memiliki signifikan efek in vitro pada radikalformasi, menunjukkan efek minimal dalam terjajah tikus.Anehnya, thiyl (atau belerang berpusat) radikal, bersama denganoksigen berpusat spesies, umumnya diamati padaisi kolon, menunjukkan bahwa campuran radikaldibentuk oleh E. faecalis dalam usus.Bahan dan MetodeKimia, Bakteri, Media, dan ProduksiSuperoxide ekstraseluler. Metanol, asetonitril, dantetrahidrofuran dibeli dari Fisher Scientific(Pittsburgh, PA). Semua bahan kimia lainnya yang analitisreagen grade dari Sigma (St Louis, MO). Enterococcusfaecalis regangan OG1RFSS merupakan turunan dari mulut manusiamengisolasi (22) dengan resistensi spontan terhadap rifampisin, fusidicasam, streptomisin, dan spektinomisin (4, 23) dan sebaliknyamirip dengan anggota spesies ini mampu menghasilkansuperoksida ekstraseluler (6). Enterococci dari ususisinya dicacah dengan empedu-esculin-azida agarpiring (Difco) seperti yang dijelaskan sebelumnya (24). Dalam tingkat in vitroproduksi superoksida ekstraseluler oleh E. faecalis adalahditentukan dengan menggunakan c uji ferricytochrome seperti sebelumnyadijelaskan (4).Usus Kolonisasi Model. Laki-laki muda Wistartikus di kelompok 13-15 hewan diberi makan ad libitum baikbasal (AIN-93M dalam bentuk pelet dengan 34 mg zat besi per kg diet,ICN, Los Angeles, CA), besi ditambah (740 mgbesi elemental [sebagai besi fosfat] per kg diet), atau fitatasam ditambah (1,2% b / b) diet. Streptomisin danspektinomisin ditambahkan ke air minum (500 mg / L)setelah 11 hari pada diet basal atau tambahan. Tigahari kemudian, pada Hari 14, saluran usus terkolonisasi denganOG1RFSS melalui intubasi lambung seperti yang dijelaskan sebelumnya (3).Lima hari setelah kolonisasi, tikus diberikan Dphenylalanine(150 mg / kg) secara injeksi intraperitoneal.Enam puluh menit kemudian, sampel urin dikumpulkan, pellet untukmenghilangkan sedimen, dan disuntikkan ke dalam kolom untuk highperformancekromatografi (HPLC) analisis cair (lihatpembahasan berikut). Pada hari berikutnya, tikusdibius menggunakan dihirup isoflurane dan titik dua dipotong.Sampel isi kolon yang diuji oleh ESR berputarperangkap, berbudaya untuk menentukan konsentrasi enterococcal,dan diuji untuk besi dan peroksida.Besi dan Tes Peroksida. Plasma besi dan besi dalamisi kolon diuji menggunakan modifikasi kecilmetode Kok dan Liar (25). Sampel yang awalnyadiasamkan dengan asam Thioglycolic terkonsentrasi dan kemudian 2 MHCl dan diencerkan 1:02 (v / v) jenuh natrium asetat.Supernatan diencerkan dalam air suling 1:3.5 (v / v) danbathophenanthroline disulfonic asam ditambahkan ke 3 mM.Absorbansi diukur pada 536 nm setelah 30 detik.Hidrogen peroksida dan hidroperoksida dalam isi kolonditentukan oleh assay glutation peroksidase sebagaidijelaskan sebelumnya (3). Dalam pengujian ini glutation peroksidasemengkatalisis reduksi peroksida menggunakan glutathionesebagai reduktor (26). Alat tes pasangan daur ulangglutathione oleh glutation reduktase dengan oksidasiNADPH. Penurunan NADPH diikuti spektrofotometripada 340 nm menggunakan koefisien kepunahan molar6,23103 L / mol / cm. Azida ditambahkan ke campuran untuk menghambatkatalase yang dapat mencemari persiapan komersialglutation peroksidase. Konsentrasi Besi dan peroksida untukisi kolon dinormalkan dengan berat basah gramtinja.Hidroksilasi aromatik D-Fenilalanin.Serangan radikal hidroksil pada D-fenilalanin dapat menghasilkansalah satu dari tiga isomer tirosin (orto-, meta-, atau para-).Produk ini berupa dalam kondisi aerobik bilaabstrak radikal hidroksil hidrogen dari aromatikcincin (27). Identifikasi isomer ini dapat digunakan sebagaipenanda pengganti untuk produksi radikal hidroksil dalam sel,jaringan, dan hewan (28). Karena D-fenilalanin bukanlahsubstrat untuk hidroksilase fenilalanin, yang biasanyaditemukan dalam jaringan, itu dianggap sebagai target yang lebih spesifik daripadaL-fenilalanin. Uji, bagaimanapun, masih bisadikacaukan oleh racemases yang mengkonversi fenilalanin kiraldari D ke L-enansiomer, dengan hidroksilase fenilalaninkemudian menghasilkan para-tirosin. Para-isomer adalah,Oleh karena itu, nilai terbatas dalam pengujian ini.HasilEnterococcus faecalis regangan OG1RFSS menghasilkansuperoksida ekstraseluler berlebihan, hidrogen peroksida, danradikal hidroksil (3, 5). Tingkat produksi superoksida,yang diukur dengan c uji ferricytochrome menggunakan glukosa sebagaigula difermentasi, adalah 31 6 1.3 lmol/min/109 cfu. Pada 15dan 30 menit, tingkat menurun menjadi 20 6 0,1 dan 13 6 1.4lmol/min/109 cfu, masing-masing. Pada 60 menit, meski memiliki banyakglukosa masih tersisa di dalam buffer, superoksida adalagi terdeteksi. Demikian pula, perangkap berputar ESR terdeteksiDMPO aduk konsisten dengan superoksida dan hidroksilradikal. Seperti dengan ferricytochrome c uji, sinyal ESRditemukan bakteri diinkubasi dengan glukosa hingga 1 jamtapi tidak di luar itu titik waktu (Gambar 1). Manggansuperoxide dismutase dieliminasi sinyal aduk, mengkonfirmasikanasal mereka dari superoksida.Ketika asam fitat besi atau ditambahkan ke E. faecalis, tidak adaPerubahan signifikan yang diamati pada DMPO adduct atauKekuatan sinyal ESR (Gambar 1). Meskipun perangkap berputar ESRlebih sensitif untuk mendeteksi superoksida daripada ferricytochromec assay (29), kami tidak dapat mengukur kinetika olehberputar perangkap karena meningkatnya intensitas sinyal, yangakan menunjukkan produksi superoksida yang sedang berlangsung, adalahtidak terlihat. Radikal yang mudah dideteksi segera setelahSelain dari perangkap berputar, tetapi meningkatkan kekuatan sinyaltidak diamati meskipun bukti untuk melanjutkan superoksidaproduksi oleh c uji ferricytochrome. Penghambatanperangkap spin bukan karena larut oleh-produk sejakpenambahan supernatan dari bakteri diinkubasi denganglukosa tidak mempengaruhi spektrum untuk bakteri baru dicuci.Demikian pula, bakteri tampaknya tidak menurunkan DMPO sejakperangkap putar diinkubasi dengan bakteri masih diproduksi spektrum saatditambahkan ke bakteri baru dicuci. Selanjutnya, oksigenKeterbatasan tidak menjelaskan pengamatan ini sejak berputarmenjebak dalam sel datar terbuka, dengan oksigen tambahan,gagal untuk mengubah sinyal aduk dibandingkan dengan spektrum dariditutup sel datar. Aduk superoksida dan hidroksilDMPO, bagaimanapun, adalah rentan terhadap pembusukan yang difasilitasioleh anion superoksida (30). Interaksi ini dapat menjelaskan,bagian, temuan ini karena di bawah ini dalam kondisi in vitroakan ada produksi terus superoksida oleh E.faecalis untuk jangka waktu lebih lama daripada durasipercobaan spin-perangkap.Karena kesulitan ini, kami memutuskan untuk memeriksaefek besi dan fitat pada produksi radikal olehmengukur hidroksilasi D-fenilalanin (5).Awalnya, setiap potensi toksisitas asam fitat pada besi atau E.faecalis regangan OG1RFSS dinilai selama semalampertumbuhan BHI dengan 2.000 lm besi atau 1000 lm asam fitat.Penghambatan pertumbuhan tidak diamati, juga superoksidaproduksi diubah yang diukur dengan ferricytochrome cuji (data tidak ditampilkan). Bakteri tumbuh di BHI sendirian dankemudian dicuci diinkubasi dalam mengandung glukosabuffer dengan 0, 10, 50, atau 200 Lm sulfat besi dan 5 Dphenylalanine mM.Setelah 60 menit, peningkatan linier yang signifikan dalamtyrosines isomer diamati (7 - sampai 23 kali lipat) dibandingkandengan kontrol tanpa tambahan zat besi (Tabel 1). Hasil inimenyarankan bahwa suplemen besi ditingkatkan produksiradikal hidroksil oleh E. faecalis, mungkin melalui Fentonreaksi. Sebaliknya, 50, 200, dan 1000 Lm asam fitatkonsentrasi menurun secara signifikan dari tyrosines isomerpada 60 menit (oleh sekitar 2 - 4 kali lipat), mungkin denganpengkhelat jejak logam dalam buffer dan menghambat Fentonreaksi (21). Kecenderungan untuk penurunan tyrosines isomer,Namun, yang sangat tidak linier seperti peningkatan iniproduk untuk besi sulfat.Selanjutnya, dampak suplemen makanan jangka pendekdengan besi atau asam fitat pada produksi radikal bebas oleh E.faecalis diperiksa menggunakan model penjajahan tikus.Baik besi atau fitat diet asam ditambah punyaefeknya pada kepadatan enterococcal kolonisasiatau konsentrasi peroksida dalam isi kolon (Tabel 2).Seperti yang diharapkan, diet besi-ditambah meningkatkankonsentrasi besi dalam isi kolon dibandingkan dengan tikusmakan baik basal atau diet asam fitat-ditambah(Tabel 2). Tidak ada perbedaan signifikan secara statistikdicatat dalam kadar besi kolon rata-rata untuk asam fitat-dilengkapi dibandingkan dengan diet basal. Untuk menentukanapakah estimasi besi mungkin telah tertutup, sebagian,oleh ketidakmampuan Kok dan liar assay untuk mendeteksi besiterikat dengan asam fitat, asam fitat (50, 100, 200, atau 1000lm) ditambahkan ke dalam larutan 80 lm sulfat besi danbesi diuji. Besi terdeteksi ditemukan menurun14%, 25%, 29%, dan 36%, masing-masing, untuk inikonsentrasi asam fitat, yang menunjukkan hanya terbataspotensi gangguan. Konsentrasi rata-ratabesi plasma untuk tikus pada diet besi-ditambah adalahditinggikan (11.7 6 2.8 LM), seperti yang diharapkan, dibandingkan dengan tikuspada basal atau fitat diet asam ditambah (8.4 6 1.3dan 9,2 6 2,8 lm, masing-masing; P = 0,02 dengan analisisvarians).Ex vivo analisis ESR produksi radikal bebas dalamisi kolon dilakukan dengan menggunakan DMPO sebagai berairberputar perangkap. Meskipun beberapa derajat variabilitas diamatidi aduk DMPO seluruh diet (Gambar 2), simulasi komputer menunjukkan hampir semua spesimen mengandung campuran hidroksil(AN = 14,9 Gauss dan aH = 14,9 Gauss) dan thiyl (atau sulfurcentered)radikal (aN = 15,0-16,3 Gauss dan aH = 15,9-20,2Gauss), dengan radikal thiyl muncul sebagai dominanspesies. Spektrum pusat aduk thiyl terletak dikekuatan medan sedikit lebih rendah dari karbon-berpusat radikaladuk, menunjukkan bahwa spesies ini memiliki nilai g yang lebih besar.Karena belerang berpusat radikal biasanya memiliki nilai yang lebih besar gdari karbon-berpusat aduk, temuan ini adalah tambahanbukti positif untuk tugas yang benar adduct ini.Karena radikal thiyl tidak diamati in vitro ketikaE. faecalis adalah berputar terjebak dalam mengandung glukosa penyangga,kami memutuskan untuk menyelidiki apakah OG1RFSS bisa menghasilkanradikal thiyl saat terkena senyawa yang mengandung sulfur,yang mungkin ditemukan dalam usus besar. Bakteri yang berputarterjebak dalam glukosa yang mengandung penyangga jenuh dengan 2 -metil-1-Propanethiol (sebuah alkylsulfide), udara-teroksidasi sistein,atau hidrogen sulfida. Setiap percobaan mengakibatkanDMPO aduk yang memiliki konstanta membelah hyperfine serupadengan yang terdeteksi dalam isi kolon (Gambar 3). Putar menjebaksolusi ini tanpa menambahkan E. faecalis tidak menghasilkanradikal terdeteksi. Tidak semua senyawa yang mengandung sulfur,Namun, yang dihasilkan radikal. Beberapa upaya dilakukan untukmenghasilkan radikal menggunakan babi musin lambung (yang berisiproporsi yang signifikan dari residu sistein) dan sisteinsaja, tapi untuk alasan yang tidak jelas, masing-masing gagal. Temuan inimenyarankan bahwa E. faecalis menjajah usus membentuk tidakhanya oksigen berpusat radikal tetapi juga radikal thiyl.Kami memutuskan sebelah menilai dalam produksi vivoradikal oleh E. faecalis menggunakan hidroksilasi aromatikassay. Sekali lagi, metode ini dipilih karena keterbatasanmengukur radikal oleh perangkap berputar ESR. Tikusterjajah dengan E. faecalis dan dikelola D-fenilalaninsecara injeksi intraperitoneal. Setelah 1 jam, orto-, meta-, danpara-isomer dari tirosin yang diukur dalam urin (Gambar 4).Tambahan zat besi atau asam fitat tidak jelasberpengaruh pada produksi radikal hidroksil, karena tidak ada yang signifikanperbedaan yang ditemukan dalam konsentrasi orto-atau metaisomersuntuk diet ini dibandingkan dengan diet basal (Tabel 3).Konsentrasi para-isomer, yang berpotensidibentuk oleh racemase fenilalanin hidroksilase dan endogen,menurun untuk besi-dan fitat asam ditambahdiet dibandingkan dengan diet basal.Penelitian ini dirancang untuk mengatasi keterbatasanteknik ini dan langsung mengukur radikal di kolonisi menggunakan perangkap berputar ESR dan hidroksilasi aromatik.Meskipun perangkap berputar membutuhkan sampel pencampuran untukmenambahkan perangkap, Tris digunakan sebagai penyangga bukan EDTA (21)atau fosfat (41) untuk membatasi generasi artifactual dariradikal. Anehnya, radikal dominan yangditemukan menggunakan DMPO sebagai perangkap putar yang sulfur dan tidakoksigen berpusat spesies. Meskipun hyperfine membelahkonstanta untuk radikal thiyl bervariasi dari sampel ke sampel,menunjukkan spesies yang berbeda atau spesies tunggal sensitif terhadapperubahan kecil dalam lingkungan kolon, kesamaan lebih dariperbedaan yang diamati, terlepas dari diet.Radikal thiyl mungkin berasal dari musinyang berisi banyak subdomain sistein kaya (42),glutathione dari sel epitel gudang ke ususlumen (43), atau sistein kaya senyawa (misalnya, mycothiol)disintesis oleh mikroorganisme usus (44). Akhirnya,kolonisasi oleh bakteri yang menggunakan sulfat sebagai elektronakseptor dapat menghasilkan konsentrasi H2S di kolonlebih dari 1 mM (45, 46). In vitro, E. faecalis ditemukanmudah menghasilkan radikal thiyl di buffer jenuh denganH2S, udara-teroksidasi sistein, dan alkylsulfide 2-metil-1-Propanethiol. Ini aduk DMPO memiliki hyperfine membelahkonstanta mirip dengan yang terdeteksi di vivo (Gambar 3). Dengan demikian,berbagai senyawa usus endogen bisa berfungsi sebagaisumber potensial untuk radikal thiyl ditemukan di kolonisinya.Radikal Thiyl telah dijelaskan berikut sisteinoksidasi (47), di iradiasi larutan berair tiol (48-50),dan dari glutathione diinkubasi dengan xanthine oxidase atauperoksidase (51-53). Seperti radikal hidroksil, radikal thiylsangat reaktif dengan konstanta laju untuk oksigen yangmelebihi 109 M / detik (47). Reaktivitas tinggi ini membatasidifusi radikal ini untuk daerah tidak jauh melampaui merekasitus generasi. Meskipun radikal thiyl yang paling seringdianggap antioksidan dalam sistem biologis (54-56), merekareaktivitas kuat bisa dengan mudah merusak molekul seperti DNA(11, 12, 57-59). Selain itu, radikal ini mungkin memiliki lainnyaefek halus seperti isomerisasi cis-transester asam lemak tak jenuh tunggal untuk mengubah membran selfluiditas (60). Pentingnya radikal thiyl dalam karsinogenesis,Namun, sebagian besar masih belum diinvestigasi.Sebagai kesimpulan, temuan kami menunjukkan bahwa E. faecalismenjajah usus tikus menghasilkan campuran thiyl danoksigen berpusat radikal. Sebuah peran spesies oksigen reaktifdalam DNA kerusakan sebagian telah dirumuskan (3, 59), tetapiapa yang penting, jika ada, ini atau lainnya radikal ada dimanfaat karsinogenesis penyelidikan lebih lanjut. Itu tidakmuncul, bagaimanapun, bahwa suplementasi zat besi seperti yang dilaporkan dalampenelitian ini (; 20 mg / hari elemental zat besi per 250 g tikus) ataupeningkatan konsumsi asam fitat secara signifikan mengubahproduksi radikal bebas dalam lumen usus untuk tikusdijajah dengan bakteri ini memproduksi superoksida (Andini Marisyah Putri)